Nhìn chung, có 3 bước chính và quan trọng trong việc sinh tổng hợp ra penicillin G (benzylpenicillin).

• Bức thứ nhất là trùng ngưng 3 amino axit—L-α-aminoadipic axit, L-cysteine, L-valine thành tripeptit.[4][5][6] Trước khi trùng ngưng thành tripeptit, amino axit L-valine phải trải qua epimer (đồng phân không gian) hóa để tạo thành D-valine.[7][8] tripeptit được trùng ngưng được đặt tên là δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteine-D-valine (ACV). Phản ứng trùng ngưng và epimer hóa được xúc tác bởi enzym δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteine-D-valine synthetase (ACVS).
• Bước thứ 2 trong sinh tổng hợp penicillin G là chuyển đổi ôxy hóa ACV mạch thẳng thành isopenicillin N trung gian có 2 vòng bởi enzym isopenicillin N synthase (IPNS), được mã hóa bởi gen pcbC.[4][5] Isopenicillin N là một chất trung gian rất yếu, do nó không thể hiện hoạt động kháng khuẩn mạnh.[7]
• Bước cuối cùng là sự chuyển hóa amin bởi enzym isopenicillin N N-acyltransferase, trong đó gốc α-aminoadipyl bênh cạnh chuỗi của isopenicillin N bị loại bỏ và thay cho chuỗi phenylacetyl. Phản ứng này được điều khiển bởi gen penDE, là duy nhất trong quá trình tạo penicillin.[4]